مهندسی آلفا- 1 آنتی تریپسین انسانی با هدف کاربرد استنشاقی

آلفا 1-آنتی تریپسین (?1at) گلیکوپروتئین 394 اسیدآمینه ای و دارای 3 جایگاه گلیکوزیلاسیون است که متعلق به خانواده سرین پروتئاز می باشد و می تواند رنج وسیعی از پروتئازها را مهار کند. ?1at ریه را از نوتروفیل الاستاز در حالت التهابی و عفونی محافظت می کند بنابراین مهارکننده نوتروفیل الاستاز نامیده می شود. عدم حضور یا عملکرد ناکارآمد ?1at در ریه منجر به عملکرد کنترل نشده الاستاز و شکست الاستین می شود که مشکلات تنفسی را به همراه دارد. ?1at نقش های بیولوژیک مختلفی شامل کنترل ترشح انسولین، فعالیت آنتی پروتئازی، محافظت از سلول های ? علیه آپپتوز القاء شده توسط سیتوکین، فعالیت به عنوان ترکیب ضد التهاب دارد اما اندام اصلی هدف این پروتئین ریه می باشد. یکی از استراتژی های درمانی برای فعالیت بهینه ?1at در حالت التهابی درمان جایگزین با استفاده از تزریق درون وریدی می باشد. در این حالت تنها 10% تا 15% از ?1at به اندام هدف یعنی ریه می رسد و احتمال آلودگی های ویروسی و باکتریایی به دلیل آنکه این ترکیب از پلاسما تهیه می شود، بالاست. استراتژی درمانی دیگر انتقال از طریق مجاری تنفسی می باشد. در این حالت نه تنها ?1at ائروسل مستقیماً به اندام هدف می رسد، بلکه از تجمع دارو اضافه در خون جلوگیری کرده و بنابراین میزان دارو بسیار کمتری مورد نیاز است. انواع نوترکیب ?1at حاصل از میزبان های یوکاریوتی مانند مخمر به عنوان میزبانی کارآمد تحت مطالعه می باشد. علاوه بر پیدایش و بهینه سازی انواع نوترکیب ?1at، تلاش در بسته بندی ?1at در میکرو و نانوذرات جهت انتقال ریوی نیز تحت بررسی است. پلی (d، l لاکتید-کو-گلیکولید) (plga) پلی مر قابل تجزیه و قابل دسترسی زیستی است که توسط سازمان دارو و غذا آمریکا (fda) برای آزادسازی مرحله ای و انتقال کنترل شده دارویی ماکروملکول هایی مانند پپتیدها و پروتئین ها تایید شده است. از آنجایی که داروهای با سایز کوچکتر در سیستم های انتقال دارو ارجح می باشند، در این مطالعه 5 ساختار کوچک شده و مهندسی شده بر اساس مطالعات تئوریک طراحی و ساخته شد. هر کدام از این توالی ها در وکتور بیانی pgapz? درج و در مخمر p. pastoris ترانس فورم شد. پس از بهینه سازی شرایط بیان در فرمانتور، پروتئین ها توسط کروماتوگرافی تعویض یونی تخلیص و فعالیت هر کدام با استفاده از تست مهار الاستاز اندازه گیری شد. دو پروتئین از پنج پروتئین بیان شده با بیشترین فعالیت انتخاب و مطالعات پلی مریزاسیون روی آن ها انجام گرفت. مشخص شد که ساختارها دارای فعالیت بیشتری از نمونه کنترل که نوع تجاری ?1at است دارند و میزان پلی مریزاسیون آنها تفاوتی با نوع تجاری ندارد. از طرف دیگر از دو تکنیک امولسیون دوگانه و امولسیون غیرآبی برای سنتز نانوذرات plga با نسبت های 50:50 و 75:25 حاوی ?1at استفاده شد. نانوذرات از لحاظ مرفولوژی سطح، توزیع سایز، تفرق اشعه x (xrd)، کارآیی انکپسوله شدن، آزادسازی in vitro دارو، اسپکتروسکوپی ftir، و کالریمتری dsc تعیین خصوصیت شدند. برای بررسی سیتوتوکسیسیتی نانوذرات، تست سیتوتوکسیسیتی سلولی بر روی رده سلولی سرطانی اپی تلیالی ریه cor l105 انجام گرفت. نانوذرات کروی با اندازه ای بین 100 نانومتر تا 1 میکرون بودند. کارآیی انکپسوله شدن با استفاده از تکنیک امولسیون دوگانه بالاتر بود. مطالعات xrd و dsc نشان داد که ?1at در حالت آمورف یا کریستال نامنظم در ماتریکس پلیمری وجود دارد. نسبت اسید لاکتیک به اسید گلیکولیک روی پروفیل آزادسازی ?1at تاثیر می گذارد. نسبت 50:50 از plga توانایی آزادسازی 60% از دارو را در 8 ساعت دارد اما نسبت 75:25 پروفیل طولانی تر و متداوم تری را نشان می دهد. مطالعات سیتوتوکسیسیتی نشان داد که نانوذرات آزاد و حاوی ?1at بر روی رشد سلولی بی تاثیر است و بنابراین سمیتی برای سلول به همراه ندارد. سپس توانایی نئوبولیزاسیون نانوذرات بررسی شد و 80% بازیافت گردید. مطالعات ریه ایزوله تهویه شده و پرفیوز شده نیز حاکی از ته نشست دارو در ریه و بازیافت 13% از ?1at بود.